Ветеринарная служба Беларуси

ВСП 49 диагностика туберкулеза

Подробности

Опубликовано: 05.12.2016 07:48

Просмотров: 11760

ПОСТАНОВЛЕНИЕ МИНИСТЕРСТВА СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

30 июля 2010 г. № 49

Об утверждении Ветеринарно-санитарных правил «Диагностика туберкулеза животных»

На основании Закона Республики Беларусь от 2 декабря 1994 года «О ветеринарном деле» и с целью гармонизации нормативной базы в области ветеринарии и обеспечения экспорта продукции животного происхождения в страны Европейского Союза Министерство сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь ПОСТАНОВЛЯЕТ:

1. Утвердить прилагаемые Ветеринарно-санитарные правила «Диагностика туберкулеза животных».

2. Контроль за исполнением настоящего постановления возложить на Главное управление ветеринарии с Государственной ветеринарной и Государственной продовольственной инспекциями.

3. Настоящее постановление вступает в силу через пятнадцать рабочих дней после его подписания.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА
«Диагностика туберкулеза животных»

ГЛАВА 1
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Настоящие Ветеринарно-санитарные правила «Диагностика туберкулеза животных» (далее – Правила) разработаны в соответствии с Законом Республики Беларусь от 2 декабря 1994 года «О ветеринарном деле» (Ведамасцi Вярхоўнага Савета Рэспублiкi Беларусь, 1995 г., № 4, ст. 2), рекомендациями Санитарного кодекса наземных животных Международного Эпизоотического Бюро (2009 год), Директивой Европейского Союза от 17 марта 1997 года (97/12/ЕЕС), требованиями Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 5th edition, 2004.

2. Настоящие Правила являются обязательными для юридических лиц независимо от формы собственности и физических лиц, а также индивидуальных предпринимателей.

3. В настоящих Правилах применяются следующие основные термины и их определения:

туберкулез – инфекционная хроническая болезнь животных и человека, протекающая с образованием в органах и тканях специфических узелков (гранулем, туберкулов), у млекопитающих животных чаще вызывают микобактерии бычьего вида (Мycobacterium bovis), у людей – человеческого вида (Мycobacterium tuberculosis), у птиц – птичьего вида (Мycobacterium avium), но инфекция и болезнь может быть вызвана нетиповым возбудителем;

инфицированные животные – животные, в организме которых присутствует возбудитель туберкулеза;

больные животные – животные с клиническими признаками туберкулеза, с обнаруженными туберкулезными изменениями при вскрытии или ветеринарно-санитарной экспертизе туш, особи неблагополучного по туберкулезу стада, у которых выявлена реакция на туберкулин или с помощью лабораторных исследований в организме обнаружен (или выделен) возбудитель туберкулеза;

источник инфекции – больные и инфицированные животные и люди, которые выделяют микобактерии туберкулеза с выдыхаемым воздухом и экскретами;

латентная туберкулезная инфекция – состояние животного, в организме которого присутствуют микобактерии туберкулеза, но видимые туберкулезные изменения и клинические признаки болезни еще не развиваются благодаря защитному действию иммунной системы или в силу трансформации и снижения патогенности микобактерий;

стадо – животное или группа совместно содержащихся животных, если в организации (на ферме) одновременно содержится более одного стада, каждое из них рассматривается как отдельная единица, имеющая свой статус по туберкулезу;

стадо, официально признанное свободным от туберкулеза, – стадо, в котором ни у одного животного нет клинических признаков туберкулеза, все животные старше 6 недель дали отрицательную реакцию на туберкулин при двукратном проведении туберкулинизации через 6 месяцев после последнего случая заболевания в стаде, все животные в организации, за исключением телят в возрасте до 6 недель, обследуются с применением внутрикожной туберкулиновой или симультанной пробы с интервалом в 1 год или сформировано из животных из стад, официально признанных свободными от туберкулеза и давших отрицательный результат внутрикожной туберкулиновой пробы через 60 дней после формирования;

стадо с приостановленным (не установленным) статусом официально признанного свободным от туберкулеза – стадо, не отвечающее требованиям, предъявляемым к стаду, официально признанному свободным от туберкулеза;

стадо неблагополучное по туберкулезу – стадо, в котором отмечается выявление реагирующих на туберкулин животных и диагноз подтвержден результатами патоморфологических или бактериологических исследований;

реагирующее животное – животное, дающее утолщение кожной складки после введения туберкулина больше определенного предела;

приостановление действия статуса стада, официально признанного свободным от туберкулеза, – происходит при выявлении у животных клинических или патологоанатомических признаков туберкулеза, обнаружении хотя бы у одного животного стада положительной реакции на туберкулин после введения в стадо животных с неопределенным статусом по туберкулезу.

ГЛАВА 2
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

4. Основная цель диагностики туберкулеза – своевременное выявление больных и инфицированных животных для предупреждения распространения инфекции, получения безопасных продуктов животноводства и организации эффективных противотуберкулезных мероприятий.

5. Возбудитель туберкулеза попадает в организм животного с аэрозолями, кормом и водой, возможно внутриутробное заражение и через поврежденную кожу.

6. Болезни предшествует латентный период с персистенцией в крови, органах и тканях микобактерий туберкулеза, в том числе в виде измененных (трансформированных, L-) форм, с развитием гиперчувствительности замедленного типа к туберкулину и образованием специфических антител. Продолжительность латентного периода зависит от состояния иммунной системы животного, дозы, вирулентности возбудителя и других причин.

7. Болезнь протекает без характерных клинических признаков, может отмечаться потеря живой массы, кашель, затрудненное дыхание, увеличение лимфатических узлов, поражение вымени и других органов. Поэтому диагностику болезни ведут путем обследования животных внутрикожной туберкулиновой пробой, ветеринарно-санитарного осмотра туш и внутренних органов при убое, проведения лабораторных исследований.

8. Реакции на внутрикожное введение туберкулина могут возникать при инфицировании животных нетуберкулезными микобактериями широко распространенными во внешней среде. Поэтому для дифференциальной диагностики применяют симультанную пробу, бактериологическое исследование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА).

9. Заболевание туберкулезом считают установленным:

у млекопитающих (кроме свиней) при обнаружении на вскрытии в органах и тканях гранулем, характерных для туберкулеза;

при микроскопическом обнаружении микобактерий в патологическом материале с гранулематозными изменениями (кроме свиней);

при бактериологическом выделении из патологического материала типичных микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого вида или M.avium у птиц;

при положительной биологической пробе.

10. О результатах лабораторного исследования на туберкулез ветеринарные лаборатории обязаны сообщить ветеринарным специалистам и руководству организаций, владельцам животных, государственному ветеринарному врачу района (города).

ГЛАВА 3
АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

11. Внутрикожная туберкулиновая проба – основной метод массовой диагностики туберкулеза. Чувствительность пробы – 70–95 % и зависит от сроков инфицирования, состояния иммунной системы и других условий. У 2–5 % больных животных может отмечаться анергия к туберкулину.

12. Исследование крупного рогатого скота с применением туберкулина проводят в порядке и в сроки, предусмотренные Санитарными и Ветеринарно-санитарными правилами по профилактике и ликвидации заболеваний, общих для человека и животных. Туберкулез, утвержденными и введенными в действие постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь и Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь от 26 марта 2010 г. № 31/21.

13. Для внутрикожной туберкулиновой пробы у млекопитающих используют туберкулин для млекопитающих с активностью:

25 000 МЕ/см³ (10 000 IU/мл) [±20 %], диагностическая доза – 5000 МЕ/0,2 см³ (2000 IU/0,2 мл);

50 000 МЕ/см³ (20 000 IU/мл) [±20 %], диагностическая доза – 10 000 МЕ/0,2 см³ (4000 IU/0,2 мл).

Выбор диагностической дозы для крупного рогатого скота зависит от эпизоотической ситуации по туберкулезу в регионе и находится в компетенции Государственной ветеринарной службы республики.

14. Коровам и молодняку крупного рогатого скота туберкулин вводят внутрикожно на границе верхней и средней третей шеи, быкам – в подхвостовую складку.

Место инъекции выбривают (выстригают), кутиметром измеряют толщину кожной складки и фиксируют ее в акте на проведение исследования, протирают кожу тампоном, смоченным 70° спиртом-ректификатом.

15. Туберкулин вводят в дозе 5000 МЕ (2000 IU) или 10 000 МЕ (4000 IU) в объеме 0,2 см³ в центр подготовленного участка градуированным 1 см³ шприцом с короткой стерильной иглой, располагая ее скошенным краем наружу под углом, в глубокий слой кожи или безыгольным инъектором. В коже в месте инъекции при правильном введении должно образоваться горошинообразное утолщение.

16. Результаты туберкулинизации учитывают через (72±3) ч путем пальпации и измерения кожной складки в месте инъекции.

Реакция на туберкулин считается отрицательной при утолщении кожной складки не более чем на 2 мм, при отсутствии отека, экссудации, некроза, болезненности или воспаления лимфатических сосудов и узлов в этой области.

Реакция на туберкулин считается неопределенной при утолщении кожной складки более 2 мм, но менее 4 мм и отсутствии отека, экссудации, некроза, болезненности или воспаления лимфатических сосудов и узлов в этой области.

Реакция на туберкулин считается положительной при утолщении кожной складки на 4 мм и более или наличии отека, экссудации, некроза, болезненности или воспаления лимфатических сосудов и узлов в области инъекции препарата.

17. Результаты замеров кожных складок до и после введения туберкулина с указанием инвентарных (идентификационных) номеров животных фиксируют в акте, в котором указывают наименование организации, фермы стада, вида и количества обследованных животных, выходных данных туберкулина и заключение по результатам исследования.

18. Реакции на туберкулин могут появляться у крупного рогатого скота при инфицировании М.avium и нетуберкулезными микобактериями, поэтому, если в стадах с официально установленным статусом свободных от туберкулеза при текущей проверке одно или несколько животных дают неопределенную или положительную реакцию на туберкулин, государственной ветеринарной службой области (района) должно быть проведено расследование причин возникновения реакций на туберкулин, включающее оценку эпизоотического состояния стада, с принятием решения о проведении лабораторных исследований по установлению или исключению туберкулеза. В стадах с не установленным статусом по туберкулезу также проводят лабораторные исследования согласно настоящим Правилам.

19. На время проведения исследований действие статуса стада, официально признанного свободным от туберкулеза, приостанавливается до выдачи заключения о наличии или отсутствии туберкулеза, которое дается на основе результатов послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы туш животных, давших положительную реакцию на туберкулин и лабораторных исследований биологического материала в соответствии с настоящими Правилами.

20. Для выяснения статуса стада допускается проведение повторной внутрикожной пробы или симультанного исследования с перепроверкой особей с неопределенной реакцией, которые проводят не ранее чем через 42 дня после выявления реагировавших животных.

Животные, не давшие при повторном проведении внутрикожной туберкулиновой или симультанной пробы отрицательной реакции, считаются положительно реагирующими и подлежат убою.

ГЛАВА 4
ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ РЕАГИРУЮЩИХ НА ТУБЕРКУЛИН ЖИВОТНЫХ В СТАДАХ СО СТАТУСОМ ОФИЦИАЛЬНО СВОБОДНЫХ ОТ ТУБЕРКУЛЕЗА

21. При выявлении реагирующих на туберкулин животных в срок не более 15 суток их подвергают диагностическому убою с последующим осмотром внутренних органов и тканей. Если у убитых животных туберкулезные изменения в органах и тканях не обнаруживают, отбирают пробы лимфатических узлов (при необходимости других органов и тканей) для лабораторного исследования.

При выявлении значительного количества реагирующих на туберкулин коров допускается применение прижизненных методов дифференциальной диагностики: ускоренное бактериологическое исследование крови, постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа, по результатам которых отбираются животные для диагностического убоя.

22. Лабораторное исследование включает микроскопию, посев патологического материала на питательные среды, исследование патологического материала и изолятов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и биологическую пробу. При получении отрицательных результатов статус благополучия стада восстанавливается.

Если при бактериологической диагностике обнаруживают измененные культуры комплекса M.bovis–M.tuberculosis, статус стада не восстанавливается до завершения полного бактериологического исследования и выполнения комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий.

ГЛАВА 5
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА С ПОМОЩЬЮ СИМУЛЬТАННОЙ ПРОБЫ

23. Симультанная проба основана на групповой специфичности аллергии, проявляющейся более выраженными реакциями на аллерген, родственный по антигенному составу микобактериям, вызвавшим у животного гиперчувствительность замедленного типа.

Симультанную пробу применяют:

для первичной диагностики туберкулеза в стадах официально признанных свободными от туберкулеза, в которых было установлено инфицирование животных нетуберкулезными микобактериями;

при установлении статуса стада путем проведения симультанного исследования с перепроверкой особей с неопределенной реакцией через 42 дня после выявления реагировавших животных;

для оценки эпизоотической ситуации на завершающих этапах оздоровления стад от туберкулеза.

24. Для симультанной пробы применяют:

туберкулин очищенный для млекопитающих в дозе 10 000 МЕ (4000 IU) в объеме 0,2 см³;

ППД туберкулин для птиц в дозе 10 000 МЕ в объеме 0,2 см³ (или комплексный аллерген из атипичных микобактерий, КАМ в дозе 1350 ЕД в объеме 0,2 см³).

Аллергены вводят с правой и левой стороны шеи в соответствии с пунктами 14, 15 настоящих Правил.

25. Результаты симультанной пробы учитывают через (72±3) ч путем пальпации и измерения кожной складки в месте инъекции.

Положительным результатом считается реакция на туберкулин, превышающая реакцию на птичий туберкулин (КАМ) на 4 мм и более, либо в месте инъекции туберкулина развились клинические признаки воспалительного отека.

Неопределенным результатом считается положительная или неопределенная реакция на туберкулин для млекопитающих, превышающая реакцию на туберкулин для птиц (КАМ) на 1–4 мм, при отсутствии клинических признаков воспалительного отека.

Отрицательным результатом считается отрицательная реакция на туберкулин для млекопитающих либо положительная или неопределенная, равная или меньшая реакции на туберкулин для птиц (КАМ), а также при отсутствии воспалительного отека в местах введения обоих аллергенов.

26. Результаты замеров кожных складок до и после введения аллергенов с указанием инвентарных (идентификационных) номеров животных фиксируют в акте, в котором указывают наименование организации, фермы стада, вида и количества обследованных животных, выходных данных аллергенов и заключение по результатам исследования.

27. Статус стада официально признанного свободным от туберкулеза восстанавливается, если при постановке симультанной пробы получены отрицательные результаты.

ГЛАВА 6
ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА И ОТБОР ПРОБ ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

28. При туберкулезе в лимфатических узлах, в органах и тканях образуются гранулемы (туберкулы) диаметром от 1 мм и более светло-серого или серовато-желтого цвета с казеозным некрозом. При генерализации туберкулезного процесса поражаются плевра, легкие, печень, почки, селезенка и молочная железа.

При заражении крупного рогатого скота микобактериями туберкулеза человеческого и птичьего видов, а также нетуберкулезными микобактериями патологоанатомические изменения, как правило, отсутствуют.

29. При экспертизе туш делают разрезы и осмотр заглоточных, подчелюстных, предлопаточных, бронхиальных, средостенных, брыжеечных, портальных, надвымянных лимфатических узлов, легких, плевры, брюшины, печени, селезенки.

30. Туберкулезные гранулемы следует отличать от изменений другой этиологии, чаще паразитарных узелков, которые содержат легкоизвлекающуюся при разрезе гомогенную массу.

31. При отсутствии видимых туберкулезных изменений или при затруднении в определении их характера отбирают индивидуальные пробы патологического материала для лабораторного исследования (заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные лимфатические узлы). Другие лимфатические узлы и внутренние органы исследуют при наличии изменений неясного происхождения.

32. Патологический материал отбирают стерилизованными инструментами в чистые (предпочтительно стерильные) стеклянные или пластиковые емкости (пакеты), которые помещают в контейнер из стерилизующегося материала или бикс для безопасности транспортирования.

33. По результатам патологоанатомического исследования составляют акт и сопроводительную на патологический материал с указанием наименования организации, фермы, стада, номеров животных, результатов аллергической диагностики и данных аутопсии.

34. Пробы доставляются в диагностическое учреждение сопровождающим лицом не позднее чем через 5 часов после отбора. Допускается хранение проб при невозможности своевременной доставки в течение 12 ч при температуре плюс 2–8 °С или в замороженном состоянии. До окончания исследования пробы хранят в замороженном состоянии.

ГЛАВА 7
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

35. Бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование и посев патологического материала на питательные среды для выделения возбудителя болезни, биологическую пробу, идентификацию изолятов.

36. Бактериологическую диагностику проводят с использованием питательных сред для ускоренного выделения микобактерий туберкулеза, которые позволяют быстро и с большой чувствительностью выявить бактериологические маркеры туберкулезной инфекции – измененные (трансформированные) микобактерии туберкулеза, а также с применением твердых яичных питательных сред Левенштейна-Иенсена и Гельберга, которые обладают меньшей чувствительностью, но позволяют выделить микобактерии туберкулеза в классической форме.

37. Использование ускоренного метода бактериологического исследования в сочетании с ПЦР благодаря высокой чувствительности позволяет в короткие сроки исключить туберкулезную инфекцию. Если при ускоренной диагностике выявляют микробиологический маркер туберкулезной инфекции (измененные формы возбудителя туберкулеза), стадо признают неблагополучным только при выделении микобактерий туберкулеза на питательных средах Левенштейна-Иенсена или Гельберга или получении положительного результата биопробы на лабораторных животных.

ГЛАВА 8
МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

38. Микроскопическому исследованию подвергают патологический материал, имеющий изменения гранулематозного характера, гиперплазию и кровоизлияния.

39. Мазки-отпечатки патологического материала готовят в боксе или в ламинарном шкафу с предосторожностями, предусмотренными при работе с микроорганизмами III группы патогенности.

40. Из патологического материала вырезают кусочки измененных участков, которые раздавливают между двумя предметными стеклами, готовя не менее 4 мазков-отпечатков, которые высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем спиртовки (фиксация сырых мазков не допускается) и окрашивают по Цилю-Нильсену. В качестве дополнительных методов используют иммунопероксидазную или иммунолюминесцентную окраску, существенно повышающие результативность диагностики.

41. Для окраски по Цилю-Нильсену необходимо:

раковина или специальный лоток для окраски;

штатив «рельсы» для предметных стекол;

пинцеты, ножницы;

газовая или спиртовая горелка;

фильтровальная бумага 4 х 1,5 см;

капельницы для красителей;

раствор карболового фуксина;

3%-й раствор солянокислого спирта;

вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

0,3%-й раствор метиленового синего;

предметные стекла;

иммерсионное масло.

42. Реактивы для приготовления красителей:

спирт этиловый, ТУ 6-09-4512-77;

кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;

метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

глицерин, чда, ГОСТ 6259-72;

вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

43. Для приготовления мазков (мазков-отпечатков) используют новые отмытые и обезжиренные предметные стекла без царапин и сколов. Перед использованием предметные стекла кипятят в 1%-м растворе двууглекислого натрия (10 г на 1 л воды), промывают в растворе соляной кислоты (10 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л дистиллированной воды), проточной водой и протирают насухо. Для обезжиривания стекла помещают в герметические емкости со смесью Никифорова или с 96-градусным этиловым спиртом (не менее чем на 24 ч). Перед использованием их протирают насухо.

44. Приготовление раствора карболового фуксина. 0,3 г основного фуксина растирают в ступке с 0,5 мл глицерина, прибавляя порциями 10 мл этилового спирта. В отдельной колбе расплавляют 5 г фенола, подогревая на водяной бане, и добавляют 100 мл слегка подогретой дистиллированной воды. 90 мл полученного раствора смешивают с 10 мл насыщенного раствора фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят не более 14 суток.

45. Приготовление 3%-го солянокислого спирта. К 97 г 96-градусного спирта этилового осторожно добавляют (наслаиванием) 3 мл концентрированной соляной кислоты.

46. Приготовление раствора метиленового синего. 0,3 г метиленового синего растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр.

47. Высушенные и фиксированные мазки:

помещают на специальный штатив «рельсы»;

кладут кусочки фильтровальной бумаги;

на бумагу наливают карболовый раствор фуксина;

нагревают до появления паров, не доводя до кипения и не допуская высыхания бумаги;

мазки охлаждают 5 мин, бумагу удаляют, стекла промывают водой;

на мазки для обесцвечивания наносят 3%-й раствор солянокислого спирта, который через 30–40 секунд промывают водой;

на 1 мин наносят раствор метиленового синего;

мазки промывают водой и высушивают.

Примечание. Допускается использование готовых красителей, предназначенных для окраски по Цилю-Нильсену.

48. Как минимум 3 мазка просматривают под микроскопом с окулярами х7 (х10), объективом х90 (х100) с иммерсией, проходя не менее 100 полей зрения по каждому (3 параллельных прохода по длине мазка или 9 параллельных проходов по ширине).

Туберкулез считают подтвержденным, если при микроскопии 300 полей зрения мазков-отпечатков с гранулематозными изменениями обнаруживают 5 и более рубиново-красных палочек 1,0–10,0 мкм в длину (иногда изогнутых, с темноватыми гранулами, встречающиеся поодиночке, реже парами или группами).

Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от микроорганизмов родов Rhodococcus, Nocardia и Legionella, цист Cryptosporidium и Isospora с частичной кислотоустойчивостью (дающих красноватое окрашивание), но отличающихся по морфологии.

При обнаружении в 300 полях зрения менее 5 рубиново-красных палочек дополнительно готовят 2 мазка для иммунопероксидазной или иммунолюминесцентной окраски.

49. Для иммунопероксидазной окраски мазков применяют:

50%-й раствор перекиси водорода;

0,1 М фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,4 (ФСБ) состава NaCl – 8 г, KH₂PO₄ – 0,2 г, Na₂HPO₄ – 2,8 г, вода дистиллированная – до 1000 мл;

конъюгат аффинно-очищенных антител к группоспецифическим антигенам микобактерий комплекса bovis–tuberculosis с пероксидазой;

3,3'-диаминобензидин гидрохлорид (ДАБ) или тетраметилбензидин (ТМБ);

диметилсульфоксид (ДМСО);

цитрат натрия;

фосфорная кислота;

мочевина;

дистиллированная вода по ГОСТ 6709;

дозаторы пипеточные 10–1000 мкл со сменными наконечниками;

шейкер типа «Vortex»;

предметные стекла.

50. Высушенные и фиксированные мазки, приготовленные согласно пункту 40 настоящих Правил:

помещают на штатив «рельсы»;

на мазки наслаивают 3%-й раствор перекиси водорода для ингибиции эндогенной пероксидазы;

после прекращения выделения пузырьков мазки осторожно промывают дистиллированной водой, после чего их подсушивают на воздухе;

на мазки на 40 мин наносят конъюгат аффинно-очищенных антител к группоспецифическим антигенам микобактерий комплекса bovis–tuberculosis с пероксидазой, разведенный ФСБ согласно указаниям на этикетке, после чего осторожно промывают ФСБ и подсушивают;

на мазки наслаивают субстратную смесь:

диаминобензидина (5 мг ДАБ растворяют в 20 мл 0,05 М трис-HCl буфере рН 7,5 и перед употреблением добавляют 2,7 мл 0,5%-го раствора перекиси водорода) – на 20 мин;

или тетраметилбензидина (раствор 1–24 мг ТМБ растворяют в 14 мл ДМСО, добавляют 6 мл дистиллированной воды; раствор 2–0,45 г цитрата натрия, 0,5 мл концентрированной фосфорной кислоты, 18 мг мочевины растворяют в 50 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют 10 мкл 50%-й перекиси водорода, растворы 1-й и 2-й смешивают перед употреблением в соотношении 1:4) – на 10 мин;

мазки осторожно промывают дистиллированной водой и высушивают, допускается после высушивания легкое прогревание на пламени спиртовки для улучшения сцепления материала со стеклом;

мазки просматривают на световом микроскопе с объективом х90 (х100) и окуляров х7 (х10) под иммерсией.

51. Микобактерии комплекса bovis–tuberculosis обнаруживаются внутри клеток или вне их в виде палочек, кокков и других форм, окрашенных в коричневый цвет (от темно-коричневого до желто-коричневого) при использовании ДАБ или в синий (красновато-синий) цвет (ТМБ) с прокрашиванием клетки в целом, а не только в виде ореола.

52. Результаты иммунопероксидазного окрашивания считаются положительными при исследовании материала с гранулематозными или с другими визуально заметными поражениями.

53. Результаты исследования мазков из неизмененных органов и культур, выделенных при бактериологическом исследовании лимфатических узлов, считаются ориентировочными и должны подтверждаться другими методами.

54. Для иммунолюминесцентной окраски применяют:

конъюгат FITC и аффинно-очищенных антител к группоспецифическим антигенам микобактерий комплекса bovis–tuberculosis;

альбумин, меченный RITC НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды);

фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) рН 7,2–7,4 (14,2 г Na₂HPO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды; 12,0 г NaH₂PO₄ растворяют в 100 мл дистиллированной воды или соответственно 17,4 г K₂HPO₄ и 13,6 г KH₂PO₄, растворы смешивают в соотношении 1:1, добавляют азид натрия (0,02 %) или мертиолат 1:1000, 8,5 г NaCl растворяют в 1 литре дистиллированной воды, к раствору добавляют 10 мл натрий-фосфатного или калий-фосфатного 1 М буферного раствора, хранят при температуре +2…+6 °С;

бактериологическая петля платиновая или стерильные одноразовые пластиковые петли;

спиртовка;

дистиллированная вода по ГОСТ 6709;

дозаторы пипеточные 10–1000 мкл со сменными наконечниками;

шейкер типа «Vortex»;

пробирки типа «Эппендорф» 1, 1,5 см³;

предметные стекла;

покровные стекла, ГОСТ 6672-75;

спирт этиловый ректификованный, ГОСТ 5962.

55. Высушенные и фиксированные мазки, приготовленные согласно пункту 42 настоящих Правил:

помещают на штатив «рельсы»;

на мазки наносят по 0,3–0,5 мл конъюгата аффинно-очищенных антител к группоспецифическим антигенам микобактерий комплекса bovis–tuberculosis с FITC в рабочем разведении;

через 45 мин мазки осторожно промывают ЗФР и подсушивают;

на мазки наносят по 0,3 мл раствора альбумина, меченного RITC;

через 20 мин промывают ЗФР и высушивают.

56. Мазки в затемненном помещении просматривают на люминесцентном микроскопе с фильтром для FITC-U-MWB2, RITC-U-MWG2, используя иммерсионный объектив х90 (х100) и окуляр х7 (х10) под нефлюоресцирующим иммерсионным маслом.

57. Результат микроскопии считается положительным (микроорганизмы относят к комплексу M.bovis–M.tuberculosis) при обнаружении клеток, независимо от морфологии, дающих зеленое свечение с интенсивностью «+++» и более.

Результаты иммунолюминесцентного окрашивания считаются положительными при исследовании материала с гранулематозными или с другими визуально заметными поражениями.

Результаты исследования мазков из неизмененных органов и культур, выделенных при бактериологическом исследовании лимфатических узлов, считаются ориентировочными и должны подтверждаться другими методами.

ГЛАВА 9
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

58. Бактериологический посев биологического материала позволяет получить культуру микобактерий, определить ее вид, вирулентность и другие свойства. При оценке результатов следует учитывать, что чувствительность бактериологической диагностики ограничивается:

сложностью обработки патологического материала и высокой вероятностью гибели 90–95 % популяции микобактерий при деконтаминации;

медленным размножением микобактерий туберкулеза и их избирательным отношением к составу питательных сред;

возможным превалированием в патологическом материале трансформированных (L-форм) микобактерий со сниженной способностью к росту на яичных питательных средах с малахитовым зеленым.

59. При бактериологической диагностике туберкулеза выполняются требования к лабораториям, работающим с микроорганизмами III группы патогенности. Продолжительность бактериологического исследования не должна превышать 3 месяцев и 6 месяцев при постановке биопробы.

60. Бактериологическому исследованию подвергают индивидуальные пробы лимфатических узлов (смесь фрагментов лимфатических узлов животного) и другие органы при наличии изменений неопределенной природы.

Для прижизненного выявления инфицированных животных применяется бактериологическое исследование стерильно взятой крови (сыворотки крови) с применением питательных сред для ускоренного выделения возбудителя туберкулеза

61. Патологический материал (лимфатические узлы, фрагменты органов) подвергают обработке для инактивации нежелательной микрофлоры.

Материал промывают стерильным 0,9%-м раствором хлорида натрия, нарезают кусочками (0,5 см) не менее 6–10 г в стерильные фарфоровые ступки. Для этого используют индивидуальные стерильные ножницы и пинцеты или их протирают стерильными ватными тампонами, смоченными стерильным 0,9%-м раствором хлорида натрия, и фламбируют перед измельчением каждой пробы.

62. Обработку измельченного материала проводят одним из способов:

3–6%-м раствором серной кислоты (для приготовления 3, 4, 5, 6%-х растворов серной кислоты (H₂SO₄) к 97 (96, 95, 94) мл дистиллированной воды добавляют 3, 4, 5, 6 мл концентрированной серной кислоты (х.ч);

4–5%-м раствором щавелевой кислоты (4 или 5 г щавелевой кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды);

4%-м раствором гидроксида натрия (4 г NaOH растворяют в 96 мл дистиллированной воды).

Растворы стерилизуют 20 мин при 1 атм.

В ступку с кусочками пробы добавляют стерильный песок или тертое стекло, смесь растирают пестиком до получения однородной массы, которую заливают (1:4–1:5) одним из приведенных выше раствором. Суспензию стерильными пипетками переносят в стерильные центрифужные пробирки, которые уравновешивают и центрифугируют 10–15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в раствор дезинфектанта или в емкость для последующего кипячения. К осадку добавляют стерильный 0,9%-й раствор хлорида натрия и повторно центрифугируют 10–15 мин при 3000 об/мин. Процедуру отмывки повторяют не менее 2 раз.

Кусочки патологического материала в ступке заливают деконтаминирующим раствором, ступку накрывают стерильной бумагой. Через 10–20 мин раствор сливают, материал 3 раза промывают (по 5–10 мин) стерильным 0,9%-м раствором хлорида натрия. Добавляют стерильный песок (тертое стекло) и растирают пестиком, добавляя стерильный 0,9%-й раствор хлорида натрия по 0,5 см³ на одну планируемую к посеву пробирку питательной среды (если ставится биопроба, объем добавляемого раствора увеличивают на 1–1,5 см³ из расчета на одно животное).

Продолжительность обработки не должна превышать 30 мин.

Отмытый осадок наносят бактериологической петлей или шпателем на поверхность питательной среды.

ГЛАВА 10
УСКОРЕННАЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

63. Для ускоренной бактериологической диагностики используют питательные среды ВКГ, «Микофаст», Влакон и соответствующие им стимуляторы роста или готовый к применению набор ТУ BY 600049853.084-2007.

64. Питательные среды для ускоренной бактериологической диагностики готовят в стерильной термостойкой посуде, не контактировавшей с микобактериями. В дистиллированной воде с рН 7,2±0,1 суспендируют необходимое количество среды, указанное в инструкции по ее применению. Смесь нагревают (в водяной бане или на газовой горелке с сеткой) при постоянном перемешивании до полного расплавления и растворения компонентов.

65. Среду разливают в термостойкие флаконы (не более 50 % от ее объема) и стерилизуют при 121 °С 15 минут. Расплавленную после автоклавирования среду разливают в стерильные чашки Петри (стеклянные или пластиковые) в объеме, обеспечивающем слой 4–5 мм.

66. Посев подготовленного материала проводят после застывания питательной среды. Допускается хранение готовых чашек с питательной средой при +6... +10 °С в течение 6–7 суток (помещенных в герметически закрытый пластиковый мешок или заклеенных скотчем).

67. Для посева обработанный материал (пункт 62, стерильно взятая кровь или сыворотка крови) с соблюдением правил асептики и антисептики смешивают со стимулятором роста. Для этого в одноразовый шприц набирают 1–2 мл стимулятора роста и 0,5–1 мл деконтаминированного материала. Шприц закрывают колпачком и помещают в термостат (37–38 °С) на 24–48 ч. После инкубации смесь высевают не менее чем на 2 чашки со средой, внося по 0,7 см³ в стандартные стеклянные чашки Петри, по 0,4 см³ – в пластиковые чашки диаметром 9 см, по 0,15 см³ – в чашки диаметром 6 см. Чашки заклеивают скотчем (или кладут в герметичные полиэтиленовые пакеты) и помещают в термостат (37–38 °С). Переворачивать засеянные чашки запрещается.

68. Посевы просматривают через 2 суток и далее ежедневно в проходящем свете, а при отсутствии видимых колоний (на 7 сутки) под бинокулярной лупой (увеличение 40–70 раз). При отсутствии признаков роста в чашку с посевом добавляют 1–2 мл буферного раствора для выделения ДНК и делают смыв с поверхности, который переносят одноразовым шприцом или автоматической пипеткой во вторую чашку с посевом. Суммарный смыв исследуют в ПЦР (пункты 101–104 настоящих Правил).

69. На средах для ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза рост микобактерий появляется через 1–7 суток в виде беловатых «восковидных» («парафиновых») колоний или сплошного «газонного» роста. При визуальном отсутствии колоний под бинокулярной лупой можно обнаружить колонии в виде темноватых возвышений.

70. Если выросшей бактериальной массы достаточно много, предварительную идентификацию проводят с использованием пластинчатой реакции агглютинации (РА) набором «Сыворотки для идентификации культур комплекса M.bovis–M.tuberculosis, выращенных на питательной среде ВКГ в реакции агглютинации (РА)» ТУ BY 600049853.108-2007 с последующей окраской результатов по Цилю-Нильсену.

71. Для постановки РА используют обезжиренные предметные стекла. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку или наконечник. Исследование проводят в боксе или в ламинарном шкафу. Перед постановкой РА просматривают посевы с ростом. Если колонии имеют одинаковую морфологию, исследуют 1–2 типичные колонии. Если колонии отличаются, в РА и соответственно в ПЦР исследуют каждую разновидность.

72. На предметное стекло наносят по 20–30 мкл 0,9%-го раствора хлорида натрия, отрицательной контрольной сыворотки и сыворотки M.bovis–M.tuberculosis. Бактериологической петлей снимают бактериальную массу, которую наносят на стекло возле каждой капли. После этого ее тщательно смешивают с каждой сывороткой. Одновременно отбирается бактериальная масса для постановки ПЦР (в 1,5 мл пробирку Эппендорф с 1 мл буферного раствора для выделения ДНК).

73. Реакцию учитывают под осветителем типа ОИ-19 или другим, обеспечивающим подсветку снизу. Культуру относят к комплексу M.bovis–M.tuberculosis, если в сыворотке M.bovis–M.tuberculosis в течение 5 минут она образует агглютинат с просветлением жидкости, а в 0,9%-м растворе хлорида натрия и в контрольной отрицательной сыворотке ее суспензия остается гомогенной.

Отрицательным считается результат РА, при котором агглютинации не наблюдается или она отмечается одновременно в отрицательной контрольной сыворотке и в сыворотке M.bovis–M.tuberculosis.

В случае сохранения у культур M.bovis–M.tuberculosis липидной оболочки возможна одновременная агглютинация в 0,9%-м растворе хлорида натрия, в отрицательной контрольной сыворотке и в сыворотке M.bovis–M.tuberculosis.

74. Для выявления микроагглютинации в случаях получения смешанной культуры, а также для дифференциации самоагглютинирующих изолятов стекла с РА высушивают, фиксируют и окрашивают по Циль-Нильсену.

Если в мазках изолятов со спонтанной агглютинацией обнаруживают морфологические элементы розово-красного цвета и характерные измененные формы возбудителя туберкулеза, изолят относят к комплексу M.bovis–M.tuberculosis.

75. Результаты идентификации изолятов в РА подтверждают в ПЦР с праймерами IS 6110, МРВ 70 или другими, позволяющими обнаруживать специфические участки ДНК M.bovis–M.tuberculosis.

76. При выделении трансформированных культур M.bovis–M.tuberculosis ускоренным бактериологическим методом удаляют источники инфекции, проводят дезинфекцию животноводческих помещений и медосмотр обслуживающего персонала.

ГЛАВА 11
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОСЕВ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ИЕНСЕНА, ГЕЛЬБЕРГА

77. Приготовление питательной среды Левенштейна-Йенсена (допускается использование готовой питательной среды):

Солевой раствор.

Компоненты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Стерилизуют 30 минут при 1 атмосфере (121 °С). Срок хранения раствора – 4 недели.

Раствор малахитового зеленого.

В стерильной дистиллированной воде растворяют малахитовый зеленый, выдерживая раствор при температуре 37–38 °С 1–2 часа. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению и должен заменяться свежим при появлении преципитата или изменении окраски.

Яичная масса.

Диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде щеткой щелочным мылом, выдерживая их 30 мин в мыльном растворе. Промывают в проточной воде, погружают в 70%-й этиловый спирт на 30 мин.

В боксе стерильным ножом разбивают яйца в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20–25 яиц). Тщательно взбивают стерильным венчиком или в стерильном миксере.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают:

Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через 4-слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого и в течение не более 15 минут разливают по 5 мл в пробирки, следя за тем, чтобы в растворе не образовывался осадок.

Свертывание среды проводят в аппарате-свертывателе типа «АСИС». Пробирки помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования косяка среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85 °С в течение 45 минут.

Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на ее поверхности свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание ухудшает качество среды. Среда с явными дефектами подлежит утилизации.

Для проверки стерильности пробирки со средой помещаются в термостат на 2–3 суток при 37 °С. В пробирках не должно быть признаков роста.

Приготовленная партия среды должна иметь дату изготовления и храниться в холодильнике при 4–8 °С с тщательно закрытыми пробками не более 30 суток.

78. Приготовление питательной среды Гельберга (допускается использование готовой питательной среды).

Среду готовят из яичной массы, молока, картофельного отвара и солевого раствора:

Молоко ставят на сутки в холодильник, снимают сливки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 110 мл в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром в аппарате Коха два дня подряд (в первый день – 15 мин, во второй – 10 мин). После стерилизации в колбе (во флаконе) остается 100 мл молока. Стерилизацию можно проводить в автоклаве, доводя температуру до 120 °С и отключая его.

Для получения картофельного отвара картофель моют щеткой с мылом, промывают проточной водой, чистят, заливают двойным количеством водопроводной воды (на 1 кг картофеля 2 л воды), кипятят 15 мин, отстаивают, отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы по 110 мл и стерилизуют так же, как молоко.

Готовят солевой раствор:

Соли и пептон растворяют в небольшом количестве воды, добавляют глицерин и остальную воду. Раствор слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 110 мл и стерилизуют так же, как и картофельный отвар.

Приготовление раствора малахитового зеленого – 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 120 °С.

Для приготовления среды в банку с бусами и взбитыми яйцами добавляют по 100 мл молока, картофельного отвара, солевого раствора и 7,5 мл 2 %-го водного раствора малахитовой зелени. Смесь тщательно размешивают, разливают по пробиркам (4–5 мл в каждую), помещают в наклонном положении в свертыватель «АСИС» или аппарат Коха, стерилизуют в течение двух суток, первый день при 85 °С, во второй – при 90 °С в течение 30 мин.

Для проверки на стерильность пробирки со средой помещают в термостат на 2–3 суток при 37 °С. В пробирках не должно быть признаков роста.

Приготовление среды Левенштейна-Иенсена (Гельберга) с салицилатом натрия. 500 мг салицилата натрия (х.ч.) растворяют в 5 мл стерильной дистиллированной воды. В приготовленную яичную среду (перед разливом в пробирки) вносят 1 мл раствора на каждые 100 мл среды, смесь перемешивают, фильтруют и разливают по пробиркам.

79. Каждую пробу деконтаминированного материала (пункт 62) высевают не менее чем на 10 пробирок среды Левенштейна-Иенсена (Гельберга) или другой среды, внося его пастеровской пипеткой (по 0,3–0,5 см³) или бактериологической петлей, распределяя по поверхности.

80. Засеянные пробирки помещают в термостат (37–38 °С) в наклонном положении. Через 3 суток их просматривают, обращая внимание на восстановление цвета среды. Пробирки с невосстановившимся цветом среды (зеленый с синеватым оттенком) выбраковывают и обезвреживают автоклавированием.

81. Посевы просматривают на 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 70, 90-е сутки. При обнаружении колоний отмечают срок их появления (в сутках), размер, форму, цвет. Наблюдение за пробирками без признаков роста продолжают.

Микобактерий туберкулеза бычьего вида (M.bovis) дают рост через 20–60 суток в виде мелких, гладких, реже шероховатых колоний цвета слоновой кости.

Микобактерии туберкулеза человеческого вида (M.tuberculosis) дают гладкие или шероховатые колонии (через 20–30 суток) цвета слоновой кости или с кремовым оттенком.

Культуры микобактерий туберкулеза птичьего вида (M.avium) растут через 10–20 суток в виде гладких беловатых колоний иногда с пуговицеобразным возвышением или кратеровидным углублением (форма «тюрбана»).

Нетуберкулезные микобактерии растут на 2–30-е сутки, образуя гладкие или шероховатые, часто окрашенные (от светло-желтого до оранжевого цвета) колонии.

82. Все выросшие колонии исследуют микроскопически. Для этого стерильной бактериологической петлей снимают часть колонии (каждой разновидности), бактериальную массу переносят на подготовленное предметное стекло в каплю стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида и растирают, добиваясь равномерного и негустого распределения. Целесообразно во избежание контаминации и потери культуры предварительно пересеять на 1–2 пробирки со средой Левенштейна-Иенсена (или Гельберга).

83. Мазки высушивают на воздухе в боксе или в ламинарном шкафу, фиксируют над пламенем и окрашивают в соответствии с пунктом 52 настоящих Правил.

84. Мазки просматривают под микроскопом с окулярами х7 или х10, объективом х90 или х100 с иммерсией, ориентируясь на окраску и характерную морфологию микобактерий туберкулеза.

Дальнейшей идентификации подвергают культуры, отнесенные к микобактериям. В таких случаях первичные колонии пересевают на 3–4 пробирки среды Гельберга (Левенштейна-Иенсена), которые культивируют при 37–38 °С для получения необходимого количества бактериальной массы.

ГЛАВА 12
ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ЯИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

85. Основная цель исследования – отличить M.bovis, M.tuberculosis (M.avium у кур) от нетуберкулезных микобактерий. Для этого используют культуральный метод, биологическую пробу, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Два последних метода дают наиболее точный результат.

86. Культуральный метод основан на том, что культуры M.bovis и M.tuberculosis растут только при температуре 37–38°С и только на твердой яичной среде (приложение).

87. Первичные колонии изолятов пересевают на 3–4 пробирки среды Гельберга (Левенштейна-Иенсена) и культивируют при 37–38 °С для накопления бактериальной массы, из которой готовят суспензию для рассева. Для этого в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон вносят 2–3 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида, бактериологической петлей снимают часть колоний (2–3 петли), которые тщательно суспендируют.

88. Суспензию пастеровской пипеткой (по 2–3 капли) пересевают на 9 пробирок мясопептонного агара (МПА), 9 пробирок со средой Гельберга (Левенштейна-Иенсена) и на 3 пробирки со средой Гельберга (Левенштейна-Иенсена) с салицилатом натрия. На пробирках делают надписи с указанием номера экспертизы, даты пересева и температурного режима культивирования.

89. По 3 пробирки с каждой средой помещают в термостаты с температурой 20–22 (комнатная температура), 37–38 и 45 °С. Пробирки со средой с салицилатом натрия инкубируют при 37 °С. 1–2 пробирки, инкубируемые при 37–38°, завертывают в темную бумагу для последующего определения способности культуры к образованию пигмента.

90. При проведении культуральных тестов необходимо использовать контрольные культуры M.bovis BCG и M.fortuitum 342 (или другой вид нетуберкулезных микобактерий), которые пересевают в соответствии с пунктами 88, 89.

91. Посевы просматривают на 3, 5, 10 и 20-е сутки. Результаты учитывают и интерпретируют, если контрольный штамм M.fortuitum через 3–7 дней дал рост при всех температурных режимах на всех средах, а M.bovis BCG вырос только на яичной среде при 37–38 °С.

М.tuberculosis и М.bovis растут только при температуре +37....+38 °С через 15–30 суток (и более), не образуют пигмент, не растут на среде с салицилатом натрия и на МПА.

М.avium растет через 10–15 суток при 20–22 (±), 37–38 и 45 °С, в том числе на среде с салицилатом натрия, и относительно скудно на МПА (±).

Нетуберкулезные микобактерии на яичной среде растут через 3–30 дней после посева в широком диапазоне температур, а многие виды – на яичной среде с салицилатом натрия и МПА.

По скорости роста и пигментообразованию можно определить групповую принадлежность изолятов нетуберкулезных микобактерий по Runyon (1959).

I группа – фотохромогенные микобактерии, дают первичный рост непигментированных колоний через 15–30 дней, которые после освещения дневным или электрическим светом становятся желтыми или желто-оранжевыми. Основной вид – М.kansasii.

II группа – скотохромогенные микобактерии, дают первичный рост пигментированных (оранжево-желтых) колоний через 15–30 дней независимо от освещения. Основные виды М.gordonae, M.scrofulaceum.

III группа – нефотохромогенные микобактерии, дают первичный рост непигментированных колоний через 15–20 дней. Основные виды М.intracellulare, М.terrae, М.gastri, М.triviale.

IV группа – быстрорастущие микобактерии, дают первичный рост колоний через 2–7 дней (бесцветных или окрашенных). Основные виды М.fortuitum, M.phlei, M.smegmatis, M.vaccae, M.flavescens.

ГЛАВА 13
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА

92. Биологическую пробу применяют для обнаружения микобактерий туберкулеза в патологическом материале и для определения их видовой принадлежности (в том числе культур, выделенных при бактериологическом посеве патологического материала). Метод применяется при необходимости по решению государственной ветеринарной службы района (области) и в случаях, если невозможно использование культурально-биохимических методов идентификации и ПЦР.

93. Для биопробы используют морских свинок живой массой 300–350 г (желательно светлой масти), кроликов массой не менее 1,5 кг, кур – 5–6-месячного возраста.

94. Перед биопробой морских свинок и кроликов исследуют туберкулином для млекопитающих, кур – туберкулином для птиц. За 1 сутки до введения туберкулина у морских свинок на боку (в непигментированном участке кожи) выщипывают или выбривают шерсть. Раствор туберкулина готовят непосредственно перед введением.

Для приготовления растворов туберкулина для млекопитающих из флакона со стандартным раствором туберкулина с активностью 50 000 МЕ/мл отбирают 0,1 мл (5000 МЕ) и смешивают с 9,9 мл изотонического раствора (растворителя для микобактериальных аллергенов или 0,9%-го раствора хлорида натрия), получая раствор с активностью 500 МЕ/мл, 0,2 мл которого содержит 100 МЕ.

Для приготовления ППД туберкулина для птиц к содержимому 1 флакона с сухим препаратом добавляют 1 флакон растворителя. 0,1 мл полученного раствора смешивают с 9,9 мл изотонического раствора, получая раствор аллергена с необходимой активностью.

95. Туберкулин вводят внутрикожно в депилированный и обработанный 70%-м спиртом ректификатом участок кожи в объеме 0,2 мл: морским свинкам на боковой поверхности тела, кроликам – в кожу наружной поверхности уха, курам – в бородку.

96. Результат туберкулинизации у морских свинок учитывают через 24 ч, у кроликов – через 48 ч, у кур – через 30–36 ч. У морских свинок и кроликов положительная реакция проявляется образованием в месте инъекции припухлости диаметром более 5 мм и гиперемией кожи, у кур отмечается опухание бородки. Для биопробы отбирают животных, не реагирующих на туберкулин.

97. Лабораторных животных заражают подготовленным патологическим материалом (по пункту 62 настоящих Правил, в котором с помощью индикаторных полосок определяют рН и доводят его до 6,9–7,2 10%-м раствором аммиака или 10%-м раствором двууглекислой соды, а крупные частицы удаляют отстаиванием или центрифугированием 2–3 мин при 500 об/мин) или выделенными культурами.

Пробой патологического материала заражают 2 морские свинки, 1 кролика, а при подозрении на наличие в материале M.avium – 1–2 курицы. Допускается объединение 3–5 индивидуальных проб животных, происходящих из одного стада (фермы). В таких случаях заражают 3 морские свинки, 2 кролика, 3 курицы.

98. Культуры микобактерий для биологической пробы снимают с питательной среды бактериологической петлей (не менее 5 мг) на предварительно взвешенную пергаментную бумагу (целлофан или полиэтиленовую пленку), которую повторно взвешивают для определения массы снятой культуры. Культуру переносят в стерильную ступку, растирают пестиком, добавляя по каплям стерильный 0,9%-й раствор хлорида натрия в объеме для получения суспензии с концентрацией 1 мг/мл.

99. Каждому животному вводят по 1 мл суспензии патологического материала или культуры. Кроликам – в краевую вену уха, морским свинкам – подкожно в область паха, курам – в подкрыльцовую вену или внутримышечно в область грудины.

100. За животными наблюдают три месяца. При заболевании и гибели трупы животных вскрывают, учитывают патологические изменения (если изменения нехарактерные, отбирают материал для микроскопического исследования). Если животные остаются живыми, через 3 месяца их подвергают эвтаназии и вскрытию.

При положительной биопробе культуру относят:

к M.bovis, если морские свинки и кролики в течение 15–90 суток заболевают или гибнут от туберкулеза с казеозным поражением лимфатических узлов, селезенки, печени, легких;

к M.tuberculosis, если морские свинки в течение 15–90 суток заболевают или гибнут от туберкулеза с казеозным поражением лимфатических узлов, селезенки, печени, легких, а кролики (в большинстве случаев) остаются живыми без развития существенных патологических изменений (единичные очажки в легких, редко в почках).

У кур микобактерии туберкулеза человеческого и бычьего видов не вызывают заболевания и видимых изменений в органах.

M.avium у морских свинок может вызывать абсцесс в месте введения или увеличение регионарного пахового лимфатического узла. У кроликов может развиваться сепсис, приводящий к гибели животных в течение 14–30 суток (тип Иерсена).

M.avium вызывает гибель кур в течение 14–30 суток. На вскрытии находят резкое увеличение селезенки и печени, при микроскопии обнаруживают значительное количество кислотоустойчивых микобактерий. У кур, убитых или павших в более поздние сроки, находят множественные серо-желтые бугорки в печени, в селезенке и в кишечнике.

Нетуберкулезные микобактерии не вызывают гибели лабораторных животных и развития у них макроскопических изменений.

ГЛАВА 14
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗА В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

101. ПЦР применяют для обнаружения ДНК M.bovis и M.tuberculosis в посевах при ускоренной бактериологической диагностике туберкулеза (пункты 63–75 настоящих Правил) для идентификации культур микобактерий, выделенных с использованием яичных питательных сред (допускается использование ПЦР для непосредственного выявления ДНК микобактерий туберкулеза в патологическом материале).

102. В основе метода лежит исследование материала, потенциально содержащего ДНК возбудителей туберкулеза с многократным циклическим повторением тепловой денатурации ДНК, гибридизации («отжига») исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В результате проведения n циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в 2'' раз (например, в миллион раз после 20 циклов), что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле или специфических зондов в реальном времени.

103. Для обнаружения ДНК возбудителей туберкулеза применяют рекомендованные в установленном порядке наборы, позволяющие выявлять специфические участки ДНК микобактерий комплекса bovis–tuberculosis и при необходимости дифференцировать M.bovis от M.tuberculosis.

104. Выделение ДНК и дальнейшие этапы с интерпретацией результатов проводят в соответствии с рекомендациями организации-изготовителя набора, выполняя требования по соблюдению техники безопасности и предотвращения контаминации проб.

ГЛАВА 15
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗОПОДОБНЫХ ЛИМФАДЕНИТОВ У СВИНЕЙ

105. Туберкулез у свиней протекает преимущественно бессимптомно. Для выявления инфицированных животных проводят аллергические исследования в соответствии с Санитарными и Ветеринарно-санитарными правилами по профилактике и ликвидации заболеваний, общих для человека и животных. Туберкулез, утвержденными и введенными в действие постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь и Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь от 26 марта 2010 г. № 31/21.

106. Гранулематозные поражения, не отличимые от туберкулезных, у свиней, наряду с M.bovis и M.tuberculosis, могут вызывать микобактерии комплекса М.avium–M.intracellulare и некоторые другие виды нетуберкулезных микобактерий, поэтому для аллергического исследования симультанно применяют туберкулины для млекопитающих и для птиц (содержимое двух 10 см³ флаконов ППД туберкулина для птиц растворяют в одном 20 см³ флаконе растворителя).

107. Место введения туберкулинов обрабатывают 70-градусным этиловым спиртом. Туберкулины вводят внутрикожно градуированным 1 см³ шприцом с короткой стерильной иглой, располагая ее скошенным краем наружу под углом в глубокий слой кожи в объеме 0,2 мл области наружной поверхности уха в 2–3 см от его основания. В кожу одного уха вводят туберкулин для млекопитающих, а симметрично в кожу другого уха – туберкулин для птиц. При правильном введении в коже в месте инъекции должно образоваться горошинообразное утолщение.

108. Учет и оценку реакции проводят через 48 часов. Реакция оценивается как положительная при образовании ощутимой припухлости в месте введения туберкулина.

109. Свиней, реагирующих на туберкулины, подвергают диагностическому убою с осмотром лимфатических узлов и внутренних органов.

110. У свиней, больных туберкулезом, на вскрытии находят обызвествленные узелки в брыжеечных, в заглоточных, подчелюстных, бронхиальных, средостенных лимфатических узлах, редко – в легких и в печени. Такие же поражения бывают при заражении микобактериями комплекса М.avium–M.intracellulare, поэтому по результатам вскрытия диагноз туберкулез у свиней не ставится. В обязательном порядке отбирают патологический материал, который подвергают бактериологическому исследованию (с посевом на яичные питательные среды), при необходимости ставят биопробу.

ГЛАВА 16
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА У ПТИЦ

111. Заболевание встречается у всех видов куриных (курица, индейка, цесарка, фазан, куропатка), реже у голубей и водоплавающих птиц (утка, гусь, лебедь) и проявляется преимущественно у птиц старше 6–8 месяцев.

112. Туберкулез у птиц протекает хронически с нехарактерными клиническими признаками. Генерализованная форма болезни проявляется угнетением, вялостью, снижением яйценоскости, истощением (атрофия грудных мышц). При поражении кишечника и печени наблюдают поносы, желтушность слизистых оболочек и кожного покрова. Иногда отмечают хромоту и опухолеподобные образования на подошвенной поверхности конечностей.

113. Для выявления больных и инфицированных птиц используют аллергическую пробу с туберкулином для птиц (сухой ППД туберкулин для птиц перед применением растворяют из расчета 1 флакон сухого препарата на один флакон прилагаемого растворителя).

114. Перед введением кожу обрабатывают 70-градусным этиловым спиртом. Туберкулин вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл (2500 МЕ) градуированным 1 см³ шприцом с короткой стерильной иглой, располагая ее скошенным краем наружу под углом, в глубокий слой кожи:

курам – в бородку;

индейкам – в подчелюстную сережку;

гусям, уткам – в межчелюстную складку;

фазанам (самкам), павлинам, попугаям, голубям, журавлям, цаплям и другим птицам – в области наружной стороны голени (предварительно удалив перья);

фазанам-самцам туберкулин вводят в пещеристое тело на голове позади наружного угла глаза.

115. Учет и оценку реакции проводят через 30–36 часов. Реакцию оценивают как положительную при образовании ощутимой припухлости в месте введения туберкулина.

116. Туберкулез считается подтвержденным, если при вскрытии реагировавших на туберкулин особей обнаруживают характерные туберкулезные изменения, в которых при микроскопии мазков, окрашенных по Циль-Нильсену, находят рубиново-красные микобактерии.

117. При падеже птиц трупы (тушки) в лабораторию направляют целиком. При отсутствии видимых изменений или затруднениях в определении природы изменений отбирают патологический материал (печень, селезенку, кишечник в области илеоцекального соединения), который подвергают бактериологическому исследованию (с посевом на яичные питательные среды), при необходимости ставят биопробу на курах.

ГЛАВА 17
ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА У ДРУГИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

118. Туберкулез у большинства видов животных протекает с нехарактерными симптомами. Наиболее часто туберкулез встречается у маралов, содержащихся в загонах с развитием генерализованного процесса.

Туберкулез у норок связан с кормлением необезвреженными отходами переработки туш крупного рогатого скота, инфицированного возбудителем болезни. Наиболее типично заболевание проявляется у молодняка. Наблюдается жажда, истощение, изредка кашель, истечение из носа, абсцессы в области головы и шеи, тусклость меха, поносы. Резко снижается плодовитость, отмечаются массовые аборты.

У лисиц и песцов туберкулез протекает менее злокачественно. При поражении кишечника, печени и лимфатических узлов наблюдают рвоту, расстройство желудочно-кишечного тракта, потерю упитанности. При поражении легких отмечают кашель, хрипы, затрудненное учащенное дыхание, одышку; печени – желтушность слизистых оболочек; центральной нервной системы – возбуждение, потерю зрения, парезы и параличи конечностей. У лисиц при туберкулезе могут поражаться глаза, особенно у 5–7-месячных щенков. При этом глазное яблоко увеличивается в объеме, выпячивается из орбиты, роговица мутнеет, зрачок теряет форму. Глазное яблоко может вскрываться с вытеканием бурой жидкости, иногда с примесью крошковатой массы. У нутрий заболевание длится не более 1–2 месяца, они быстро худеют и погибают от истощения.

Собаки достаточно устойчивы к возбудителю туберкулеза. При развитии болезни у них может отмечаться субфебрильная температура тела, понижение аппетита, исхудание, вялость, учащение пульса и дыхания, одышка, кашель.

Туберкулез у кошек встречается редко. В случаях заболевания отмечаются резкое исхудание и анемия, затрудненное дыхание, увеличение и нагноение околоушных, подчелюстных и предлопаточных лимфатических узлов. Часто поражается кожа на голове или шее, особенно на веках, спинке носа.

Овцы и козы относительно редко болеют туберкулезом, при развитии болезни специфических признаков не отмечается.

119. Диагностику болезни ведут с применением внутрикожной пробы с туберкулином для млекопитающих в дозе 5000 МЕ/0,2 см³ (2000 IU/0,2 мл).

Туберкулин внутрикожно в объеме 0,2 мл градуированным 1 см³ шприцом с короткой стерильной иглой, располагая ее скошенным краем наружу под углом, в глубокий слой кожи:

верблюдам – в кожу брюшной стенки или области паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра;

собакам, волкам и другим представителям хищных – в области внутренней поверхности бедра или локтевой складки;

дельфинам – в кожу спины в области переднего ласта;

кошкам – в области внутренней поверхности уха;

обезьянам, сумчатым, пушным зверям (норкам, песцам, лисицам) – интрадермопальпебрально в верхнее веко;

овцам и козам подкожно в нижнее веко, отступив от его края на 1,5–2 см;

лошадям туберкулин закапывают пипеткой в конъюнктивальный мешок.

120. Перед введением туберкулина волосяной покров у животных (кроме овец, коз и норок) в месте инъекции выстригают, перья выщипывают, кожу обрабатывают 70-градусным этиловым спиртом ректификованным. Вводить туберкулин в кожу, имеющую травматические повреждения, уплотнения и абсцессы, пораженную грибками, клещами или гельминтами, запрещается.

121. Учет реакции проводят через 72 часа после введения. Основным критерием является наличие в месте введения воспалительного отека, у лошадей – гнойного истечения из глаза.

122. Для постановки диагноза решающими являются результаты вскрытия (обнаружение макроскопических туберкулезных изменений) и бактериологического исследования патологического материала в соответствии с настоящими Правилами.

123. Для отбора крупного и мелкого рогатого скота для диагностического убоя, для диагностики туберкулеза у разных видов животных, особенно при невозможности проведения внутрикожной пробы с туберкулином, применяют иммуноферментный анализ с использованием универсального набора реагентов для выявления в крови антигенов возбудителя туберкулеза и их комплексов с антителами, включающий:

разборный или цельный 96-луночный планшет с иммобилизованными антигенами M.bovis;

отрицательную контрольную сыворотку крови (К-), 1,5 см³ в пластиковой пробирке № 1;

контрольный препарат (ТБК+), 1,5 см³ в пластиковой пробирке № 2;

тест-антисыворотку к антигенам возбудителя туберкулеза (кроличья), 0,15 см³ в пластиковой пробирке № 3;

концентрат фосфатно-солевого буфера с детергентом (ФСБ-Т), 10 см³ во флаконе № 4;

конъюгат пероксидазный антикроличий, 0,5 см³ в пробирке № 5;

хромоген-субстратный буферный раствор (ХСБР), 11 см³ во флаконе № 6;

стоп-реагент, во флаконе № 7, 6 см³.

124. Материалом для исследования служат сыворотка или плазма крови любого вида животных (кроме кролика), которые получают общепринятыми способами в объеме 2–3 см³.

125. Содержимое флакона № 4 с ФСБ-Т доводят до 100 см³ дистиллированной водой. Готовый раствор используют для разведения тест-антисыворотки, конъюгата и отмывания лунок после каждого этапа реакции.

126. Из пробирки № 3 отбирают 50 мкл тест-антисыворотки и смешивают ее во флаконе с 15 см³ раствора ФСБ-Т, получая разведение 1:300 (если в выходных данных набора не указано другое разведение).

127. Для подготовки к постановке реакции применяют хорошо отмытые дистиллированной водой, высушенные планшеты или специальные панели (стрипы) для разведения образцов. В лунки рядов (1, 3, 5, 7, 9, 11) вносят по 125 мкл разведенной тест-сыворотки (можно 8-канальной пипеткой).

128. В лунки В5, С5 добавляют по 125 мкл К-, - Д5, Е5 - ТБК+ в остальные лунки, заполненные тест-антисывороткой, вносят исследуемые пробы (по 125 мкл).

129. Планшет с подготовленными образцами закрывают крышкой, выдерживают 30–35 мин в термостате (37 °С) и 20–25 мин при комнатной температуре, после чего по 100 мкл содержимого лунок переносят в лунки планшета с сорбированными антигенами (из лунки А1 в лунки А1 и А2, из лунки В1 в лунки В1, В2 и т.д.). После внесения смесей планшет инкубируют на шейкере 60 мин при 37 °С.

130. После инкубации содержимое лунок удаляют и 3-кратно промывают ФСБ-Т (по 150 мкл).

131. Содержимое пластиковой пробирки № 5 с пероксидазным конъюгатом разводят в 12 мл ФСБ-Т. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл разведенного конъюгата. Планшет инкубируют на шейкере 60 мин при 37 °С, после чего 3-кратно отмывают ФСБ-Т.

132. Из флакона № 6 во все использованные лунки планшета вносят по 100 мкл ХСБР. После развития заметной синей окраски в лунках с К- реакцию останавливают внесением во все лунки по 50 мкл стоп-реагента.

133. Учет результатов проводят на спектрофотометре при 450 нм, установив «0» по оптической плотности (ОП) воздуха. Результаты учитывают и интерпретируют, если средний показатель ОП в лунках К- – 0,4 и более опт. ед., а интенсивность реакции (ОП) в лунках с ТБК+ на 40 % и более меньше, чем в лунках с К-.

134. Для каждой пробы вычисляют средний показатель ОП и определяют процент снижения активности тест-антисыворотки пробой по формуле

(ОП средн. пробы : ОП средн. К-) х 100 % – 100 %.

135. Позитивной считается проба крови, снижающая активность тест-антисыворотки на 30 % и более. Это свидетельствует о размножении в организме возбудителя туберкулеза, накоплении в крови микобактериальных антигенов и их циркуляции в составе иммунных комплексов со специфическими антителами.

Показатель  –20…–29 % расценивают как сомнительный результат. В таких случаях целесообразно через 20–30 дней провести повторное обследование.

136. Тест-антисыворотка к антигенам возбудителя туберкулеза может быть заменена готовым конъюгатом аффинноочищенных антител к антигенам M.bovis. В таких случаях пробы смешиваются непосредственно с рабочим разведением конъюгата, вносятся в лунки панели с последующей инкубацией, промывкой и внесением субстратной смеси.

Культуральные и патогенные свойства микобактерий

• Назад
• Вперёд